混合淋巴细胞培养有反应，TB群体反应抗体检测有反应，MTB抗

原理：又称混合淋巴细胞培养，是指两个无关个体、功能正常的淋巴细胞在体外混合培养时，由于HLA II类抗原中D和DP抗原不同，可相互刺激对方的T细胞发生增值，此为双向混合淋巴细胞培养，若将其中一方的淋巴细胞先用丝裂霉素C处理或照射使之细胞中DNA失去复制能力，但仍能刺激另一方淋巴细胞发生转化，成为单向混合淋巴细胞培养。两个个体间HLA抗原差异程度越大，反应越强烈，可通过细胞数量、形态检查或3H-TdR掺入率检测反应细胞的增值水平。
通常用于器官移植前的组织配型。

实验室检查：
1、遗传检查
(1)对疑有遗传性疾病者，夫妇双方均应做染色体核型检查，或进一步做夫妇的家系遗传学调查和系谱绘制。
(2)系谱分析：通过家系调查，分析遗传性疾病对未来妊娠的影响。
(3)核型分析：同时检测夫妇双方外周血淋巴细胞染色体，观察有否数目和结构畸变及畸变的类型，推测其复发概率。
(4)分子遗传学诊断：目前部分基因遗传病可通过分子遗传学检查做出诊断。
2、内分泌诊断
(1)基础体温测定(BBT)：基础体温能反应卵巢的功能状态，可用于筛查黄体功能不全。因为黄体功能不全可引起习惯性流产，黄体功能不全者基础体温表现为：高温相小于11天;高温相体温上升幅度小于0.3度。
(2)子宫内膜活检：个体间月经周期长短变异较大，主要是卵泡期长短不同的结果，而黄体期时限及内膜变化基本一致。黄体末期做子宫内膜活检，如内膜成熟度落后，即可诊断黄体功能不全。内膜活检除做常规的组织学检测外，最好同时做雌激素受体测定。子宫内膜雌孕激素受体含量低，即使黄体功能正常，孕激素充足，内膜成熟度仍落后正常水平，是为假性黄体功能不全。
(3)激素测定，包括雌激素和孕激素、绒毛膜促性腺激素等的定量检测。血清孕酮测定：月经周期中外周血中的孕酮主要来自排卵后所形成的月经黄体，其含量随着黄体的发育而逐渐增加，至黄体发育成熟，即黄体中期，血中孕酮含量达高峰，然后不断下降，月经前期达最低水平。整个黄体期中外周血的孕酮含量变化呈抛物线状。黄体功能不全时，孕激素分泌量下降，因而测定外周血孕酮水平可反映黄体的功能状态。血清孕酮水平大于每毫升3微克(即3ng/ml)，表明卵巢已有排卵，黄体中期孕酮水平大于每毫升15微克(即15ng/ml)表明黄体功能正常，小于此为黄体功能不全。
(4)血清泌乳素(PRL)测定：血清泌乳素由垂体前叶分泌，主要功能为产后促进乳汁分泌。同时血清泌乳素对维持正常的黄体功能亦有重要作用，过低或过高均可导致黄体功能不全。临床常见的是血清泌乳素分泌过多的高泌乳素血症。血清中血清泌乳素正常值为每毫升4～20微克，大于20微克为升高。血清血清泌乳素轻度升高与反复流产关系密切。因血清泌乳素过高则严重干扰性腺轴功能，导致无排卵和不孕。
3、免疫学检查
(1)首先应用混合淋巴细胞培养反应(MLR)及淋巴细胞毒性抗体测定，鉴别原发性与继发性流产。原发性流产多发生在妊娠20周以内，丈夫和妻子比正常配偶共有更多的人类白细胞抭原(HLA)，妻子不具有抭配偶免疫，对丈夫表现出较微弱的混合淋巴细胞培养反应，血清不含有混合淋巴细胞培养阻断因子，白细胞治疗有效。继发性流产配偶间不共有人类白细胞抭原(HLA)，妻子有补体依赖或补体非依赖抗配偶淋巴细胞毒性细胞，对一组细胞显示多性抗体，肝素治疗有效。女方对男方的单相混合淋巴细胞培养，并和无关第三者的抗原做比较。如女方对丈夫表现为微弱或缺少混合淋巴细胞反应，提示妻子血中无抗父系抗体，与丈夫有相同的人类白细胞抭原。
(2)抗精子抗体的测定：如抗精子抗体阳性，提示生育力低。抗精子抗体滴度高和宫颈黏液中有抗精子抗体对生育影响大。可用精子凝集试验检测精子凝集抗体，精子制动试验检测精子制动抗体，免疫珠试验检测精子结合抗体。
(3)抗磷脂抗体(APA)测定：怀疑患自身免疫性疾病者要检测抗磷脂抗体，可采用酶联免疫吸附法等直接测定女方血清中抗磷脂抗体及其滴度。
(4)自然杀伤细胞活性测定：孕前自然杀伤细胞活性高预示下次妊娠流产的可能性大。
(5)母体抗父系淋巴细胞毒抗体测定：将夫妇双方淋巴细胞加补体共同孵育，然后计数死亡细胞的百分数，如死亡细胞在90%以上，为正常妊娠，低于20%则多发生反复流产。
(6)血型及抭血型抗体测定：丈夫血型为A或B、或AB型，其妻子为O型又有流产史者，再怀孕时应进一步检查丈夫是否属于O型，O型不引起ABO血型不合。反之丈夫为A或B或AB型时则应考虑检测妻子有无抗A，抗B或抗AB抗体，并做好妊娠监测以防止流产、死产。
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4、内生殖器畸形的检查
(1)子宫输卵管造影(HSG)：子宫输卵管造影是诊断子宫畸形敏感而特异的方法，根据子宫腔形态有否异常或充盈缺损，可判断有否子宫畸形。如造影显示宫颈内口直径大于6毫米，则可有助于诊断宫颈功能不全。
(2)超声检查：超声在诊断宫腔异常方面不如子宫输卵管造影，但在诊断子宫外部形态异常中意义较大。如超声检查配合子宫输卵管造影有助于纵隔子宫和双角子宫的鉴别诊断;超声波检查可明确子宫肌瘤的数目、大小及部位。
(3)磁共振成像：虽然费用高，但在判断内生殖器畸形方面作用很大。
(4)腹腔镜和宫腔镜：两者可直接观察子宫外部形态和宫腔内状况，能明确子宫畸形及其类型。宫腔镜还可确诊宫腔黏连，并能进行一定程度的治疗。腹腔镜还可诊断和治疗盆腔病变，如盆腔黏连、子宫内膜异位症等。
(5)宫颈扩张器检查：用8号子宫颈扩张器伸入宫颈内口毫无困难时提示宫颈功能不全。
5、病原体感染的检查尿、宫颈黏液培养了解有无微生物感染。病原体感染也是引起反复流产的原因，应行宫颈分泌物支原体、衣原体、β-溶血性链球菌等培养。一般情况下，TORCH检测(弓形体、风疹病毒、巨细胞病毒、疱疹病毒免疫检测法)及其他病原微生物抗体测定意义不大，除非病史提示有慢性感染者。流产后妊娠物应进行病理检查。

孟海英 侯一平
HLA-G属非经典的HLAⅠ类分子,与经典的HLAⅠ类分子相比它有3个特点:(1)多态性水平低;(2)体内分布局限于特定组织;(3)由于内含子和外显子间的剪接位点改变可形成4种膜结合型和两种可溶型HLA-G异构体.过去几年大量研究结果表明,HLA-G是一种免疫耐受分子.
人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)G,E和F同属非经典的HLAⅠ类基因(HLAⅠb),是继HLA-A,HLA-B,HLA-C和HLA-E之后发现的第5个HLAⅠ类基因.HLA-G最早由Geraghty等[1]克隆并测序,由于它存在于6.0kb的HindⅢ酶切片段中,被命名为HLA-6.0.1988年McAlpine建议为避免在命名中使用标点符号,将该基因命名为HLA-60.1990年在Bodmer等[2]发布的HLA命名通报中将该基因正式命名为HLA-G.
HLA-G位于6号染色体HLA-A端粒侧,其基因结构与HLA-A,HLA-B和HLA-C相似,但提前出现的终止密码使其编码的蛋白产物胞内段仅6个氨基酸,比经典HLAⅠ类抗原的30个氨基酸明显缩短.HLA-G的这一结构特点,加上启动子区结构与鼠的HLAⅠ类基因Qa相似,提示该基因与Qa基因同源. 1992年Geraghty等发现,在HLA-A和HLA-G之间有一个高度多态的区域,这一区域在某种HLA单倍型时缺失,使两基因之间的距离缩短50kb以上.1993年Morales等报道了3个新的HLA-G等位基因,从而证明HLA-G基因有多态性.
到2000年10月止,共发现14个HLA-G等位基因,其中5个有氨基酸序列异,即G*0101,G*0102,G*0103,G*0104和G*0105N.G*0101包括8个编码序列不同,但没有氨基酸序列差异的等位基因,即G*01011～G*01018.G*0104包括3个类似的等位基因,即G*01041～G*01043.G*0105N在外显子3第1597位,即第130密码子的胞嘧啶缺失使读码框架改变,终止密码在第4外显子起始部位第189密码子提前出现,正常HLA-G1分子跨膜区不能被转录,形成一个可溶型HLA-G分子.从以上资料可以看出,HLA-G的多态性远低于经典HLAⅠ类基因.且HLA-GDNA序列在经典HLAⅠ类分子的功能必需区高度保守,与经典HLAⅠ类核酸高变区相应的HLA-G区域多态性有限[3].关于HLA-G多态性在不同群体中分布的研究结果令人困惑.有研究显示HLA-G多态性在高加索人群和美国黑人间的分布差异有显著性,在美国黑人女性群体中的杂合度可达67%,其中大多数多态性出现于编码α2结构域的序列中[4].有人借助逆转录-聚合酶链式反应分析HLA-GmRNA多态性,发现在高加索和非洲加勒比海人群中,其多态性远低于上述报道,其原因可能是前者的引物选在外显子区,而不是象以前的实验选在内含子区[5]. 胎盘中存在的另一种细胞因子IL-10,可上调人类滋养层和单核细胞HLA-G表达[10].干扰素也可实验性提高转染鼠滋养层HLA-G基因表达.
HLA-G蛋白产物以两种形式存在,即表达于细胞表面的膜结合型(membrane-boundHLA-G,mHLA-G),以及存在细胞内的胞浆可溶型(solubleHLA-G,sHLA-G).在DNA多态性基础上,HLA-GmRNA包括一个全长的HLA-GmRNA(HLA-G1)和3个跨膜区缩短的HLA-GmRNA(HLA-G2,3和4),及两个无跨膜的异构体,蛋白水平仅观察到1个包括完整跨膜区的mHLA-G分子(HLA-G1)及sHLA-G,未观察到跨膜缩短的HLA-G分子,它们留在内质网中,可能对细胞表面HLA-G1或HLA-E表达起调节作
用[11].HLA-G*0105N基因的表达产物就是一种sHLA-G.膜结合型和胞浆可溶型HLA-G分子都可与细胞内来源的相同肽片段结合. HLA-G分子的功能尚不清楚.有人认为它可能与血管生成和(或)胎盘形成有关,目前普遍接受的观点认为HLA-G是一种免疫耐受分子,可能与母胎耐受及抗感染免疫有关.大量的体内外实验及临床研究已证实这种观点,但也有少数报道否定上述观点,基于HLA-G是一种免疫耐受分子,其在习惯性流产,先兆子痫,感染性疾病,肿瘤和其他免疫相关性疾病发生中的作用,及在防治移植排斥反应中的应用受到关注.1998年在法国巴黎召开了第1届国际HLA-G会议,标志着HLA功能研究的进一步深入,同时也说明HLA-G的重要性[12].3.1抗原递呈功能1994年Onno等提出一种关于HLA-G功能的假设;在不利因素(如感染,转化)的刺激下,HLA-G蛋白的合成被诱导,通过某种机制,受损伤的体细胞被靶向性杀伤,达到免疫清除的目的.实验证实,用热休克蛋白,亚砷酸盐等处理,肿瘤细胞株内各种HLA-G同源异构体转录水平提高,而HLA-A,-B,-E和-F等HLAⅠ类基因的转录水平无明显改变,说明HLA-G分子可能作为一个信号分子调节人类对各种不利因素的免疫应答.此外,mHLA-G和sHLA-G都可与来源于细胞内的相同类型的9肽片段结合,这些9肽片段的锚着残基分别是第2位的亮氨酸或异亮氨酸,第3位的脯氨酸和第9位的亮氨酸.当这3个锚着位点同时被甘氨酸替代时,该肽片段不能与HLA-G分子结合,但这3个锚着位点中任意一个位点的替代,不影响肽片段与HLA-G分子结合[13].与HLA-A2递呈的抗原肽比较,HLA-G分子可递呈的抗原肽种类较少.因此不能排除HLA-G分子具有结合和递呈抗原的功能.3.2HLA-G与母胎免疫耐受胎盘植入期,绒毛膜外滋养层(extravilloustrophoblast,EVT)通过子宫蜕膜向子宫螺旋动脉靠近的过程中,滋养层损伤动脉壁,使胎儿从母体获得足够的血流供应.与其它细胞不同,EVT细胞表达HLA-C,HLA-E和HLA-G3种HLAⅠ类分子,其中高水平表达HLA-G是EVT细胞所独有.虽然在肿瘤及其他组织中也发现有少量HLA-G分子,但都没有观察到象EVC组织中一样的HLA-G积聚.HLA-G分子独特分布可能和HLA-E一样,在母胎免疫耐受中发挥作用.
3.3HLA-G与NK细胞胎盘侵入期,表达HLA-G的胎儿滋养层侵入母体组织,母体NK细胞识别胎儿细胞表面HLA-G的刺激信号产生细胞因子,这些细胞因子调节胎盘生长,发育和分化,并使母体对HLA半异源的胎儿产生免疫耐受.妊娠各阶段子宫的白细胞类别及胎儿组织表达的各种细胞因子受体不同,滋养层与子宫细胞间的作用方式相当复杂,包括各种细胞因子,细胞因子受体,粘附分子,酶和激素,这些因素都随着妊娠阶段不同而发展变化.至少有4种NK细胞表面的杀伤细胞抑制性受体(killer-cellinhibitoryreceptor,KIR)可识别HLA-G分子,它们分别是CD94/NKG2,LIR-1,CD158a/p58.1NKR和KIR2DL4.母体中大量CD16-,CD56+NK细胞浸润子宫蜕膜,在子宫蜕膜基底部,即EVT细胞的侵入部位,NK细胞聚集更为明显,它们与侵入蜕膜的EVT细胞紧密接触.这种NK细胞表达各种识别HLAⅠ类分子的受体,如CD94/NKG2.因此,胎儿细胞表面HLA-G分子可能通过与母体NK细胞表面KIR结合,抑制NK细胞杀伤活性,从而导致母体对HLA半异源性胎儿产生免疫耐受.用蜕膜来源的NK细胞和NK细胞克隆进行的实验证实,HLA-G分子可与母体蜕膜中NK细胞表面受体结合,抑制NK细胞杀伤活性.HLA-G分子与CD94/NKG2受体的作用可被抗CD94/NKG2受体抗体阻断,使表达HLA-G分子的细胞被人体胎盘的CD94/153 NKG2阳性NK细胞杀伤[14].Dorling等[15]研究表明,除抑制NK细胞杀伤活性外,HLA-G分子可抑制NK细胞游走.另一方面,在HLA-G低表达时,EVT细胞以剂量依赖的方式被NK细胞杀伤[16].3.4HLA-G与细胞毒性T细胞据认为HLA-G分子还可通过与细胞毒性T(cytotoxicTlymphocyte,CTL)细胞作用,保护胎儿免受母体CTL细胞杀伤.HLA-G分子与CTL的作用有几个特点:
(1)抗原肽剂量依赖性;
(2)可被抗HLA-G单克隆抗体阻断;
(3)在HLA-E/CD94/NKG2A途径被阻断后,抑制作用依然存在;
(4)HLA-G分子浓度依赖性[17].
在混合淋巴细胞培养实验中,用各种浓度的纯化HLA-G检测其对CTL细胞反应能力的影响,结果表明≥0.1g/ml的HLA-G可抑制30%～100%的异源CTL细胞杀伤活性;0.01～0.05g/ml的HLA-G可使异源CTL细胞杀伤活性提高25%～50%;≤0.001g/ml的HLA-G分子对异源CTL细胞杀伤活性无影响.≥0.1g/ml的HLA-G分子诱导辅助性T细胞2(Thelpertype2,Th2)介导的免疫应答,而0.01～0.05g/ml的HLA-G分子诱导Th1介导的免疫应答[18].且由于α3结构域(第223～229氨基酸)氨基酸序列的差异,使HLA-G分子与经典HLAⅠ类分子构象不同,导致HLA-G分子与CD8结合能力显著高于经典HLAⅠ类分子[19].3.5sHLA-G的功能除mHLA-G,sHLA-G也存在于整个妊娠期母胎接触面及母体血循环中,据认为可能是妊娠期一种特异性免疫抑制分子.1999年Menicucci等[20]发现sHLA-G存在于卵细胞培养液中.2000年Hunt等[21]通过酶联免疫吸附实验用抗sHLA-G的mAb检测,发现sHLA-G存在于妊娠各阶段,孕妇血清中sHLA-G水平明显高于非孕妇,其主要同源异构体是sHLA-G2.Fournel等通过亲合纯化得到与β2微球蛋白结合的sHLA-G1可诱导活化CD8+细胞凋亡.Western杂交结果显示,sHLA-G1可促进活化CD8+细胞表面CD95配体表达.将CD8+细胞与CD95mAbZB4或可溶性CD95-Fc重组体一起预孵育,CD8+细胞的细胞毒性被抑制,提示CD8+细胞凋亡可能是通过CD95/CD95配体途径.sHLA-G1诱导的凋亡依赖于CD8分子参与,抗CD8mAb可阻断程序性细胞死亡[22].3.6HLA-G对HLA-E表达的调节作用HLA-G分子引导序列的肽片段可与HLA-E分子结合而被递呈至细胞表面,通过和NK细胞表面CD94/NKG2受体结合,产生NK细胞抑制信号. 4.1
HLA-G与先兆子痫先兆子痫(pre-eclampsia,PE)是一种常见的产科综合征,其病理学特征是胎儿滋养层侵入母体蜕膜螺旋动脉缺乏或程度不足.目前尚未发现该病特异性病因,流行病学研究显示先兆子痫具有高度家族性倾向,疾病连锁分析表明胰岛素样生长因子Ⅱ(insulin-likegrowthfactorⅡ,IGF-Ⅱ)和HLA-G是PE的候选基因.PE患者HLA-G基因第8外显子的插入/缺失多态性分布显著性偏离Hardy-Weinberg平衡,表现为杂合度过高.另外,粘附分子异常表达可能也有助于滋养层异常侵入,患者子宫蜕膜中Th1水平也与滋养层侵入特性有关.RNA原位杂交实验显示,正常妊娠时HLA-G表达于EVT,表达水平与侵入蜕膜的深度成正比,在多数PE患者的胎盘中HLA-G缺乏或表达水平降低
[23].结合上述HLA-G分子与CTL作用的浓度依赖,推测低浓度HLA-G分子可能与Th1水平上改变及
先兆子痫的发生有关.新近报道发现HLA-G*0105N纯合型的健康个体[24].也有其它群体遗传学资料显示,HLA-G*0105N的等位基因频率与先兆子痫和宫内发育迟滞无关,提示膜结合型HLA-G分子对
妊娠和胎儿成活可能并非必需.
4.2
HLA-G与病毒感染据认为HLA-G分子可与病毒来源的抗原肽结合,并把它们递呈给母体免疫系统,引起被感染胎儿组织溶解.因此,它可能在人类巨细胞病毒(humancy-tomegalovirus,CMV)感染中发挥一定作用,与习惯性流产有关.已有报道显示,两个患有习惯性流产的妇女是无效等位基因HLA-G*0105N的纯合子.人类CMV可调节HLA-G表达,但这方面的研究结果相当混乱.Onno等研究表明,单核细胞被CMV感染后,由其分化而成的组织巨噬细胞表达HLA-G,而CMV在上调HLA-G表达的同时,下调部分经典MHCⅠ分子表达.急性CMV感染性肺炎患者支气管肺泡的巨噬细胞中也表达HLA-G,在U-373MG星形细胞瘤细胞中也可发现CMV感染与HLA-G(包括sHLA-G)表达上调有直接关系.Jun等[25]认为,人CMV的US3和US6蛋白下调HLA-G表达,US3在内质网与HLA-G直接接触,使HLA-G滞留在内质网;US6通过TAP抑制肽转运.习惯性流产患者NK细胞活性异常增强,这也可能与CMV下调HLA-G表达有关.如果HLA-G是一种免疫耐受分子的假设成立,HLA-G分子应该有助于CMV逃脱宿主的免疫监视[26].此外,有研究显示HLA-G表达于各种感染性肌病的肌纤维中.在正常人和患者的培养成肌细胞中加入干扰素γ,可诱导细胞表达各种HLA-G异构体,提示在感染性肌病和其他局限性免疫应答中,HLA-G分子可能发挥重要功能[27].
4.3
HLA-G与肿瘤免疫HLA-G还可表达于实体肿瘤(如黑素瘤,肉瘤和淋巴瘤).在原发性黑素瘤细胞和转移细胞表面高表达各种HLA-G异构体[28].这些HLA-G分子使肿瘤细胞能逃避NK细胞和CTL细胞的杀伤,溶解作用,这是一种新的肿瘤细胞逃脱免疫监视的机制.非实体肿瘤,绒毛膜癌的发生也可能与HLA-G分子抑制NK细胞的杀伤作用有关.
4.4
HLA-G与移植排斥HLA-G可能通过抑制NK细胞和(或)CTL细胞激活而下调移植排斥反应.HLA-G分子的参与有助于在供受者HLA不相配时提高移植受者生存率,并可能抑制异种移植排斥.HLA-G分子抑制移植排斥反应的机理尚不清楚.除通过调节HLA-E分子表达间接作用于NK细胞,HLA-G还可通过NK
细胞表面的CD94/NKG2受体直接抑制NK细胞的活性.猪内皮细胞表达的HLA-G分子可直接抑制人NK细胞对猪内皮细胞的异源杀伤作用,其抑制作用可被抗CD94抗体阻断[29].同时,HLA-G分子也可抑制NK细胞向移植物内皮细胞移动.此外,HLA-G分子还可抑制异源T细胞增值,降低T细胞对异源细胞的杀伤作用.2000年Lila等[30]对31例心脏移植患者进行253 心脏活检,发现5例HLA-G分子的表达与急性移植排斥反应水平显著降低及缺乏慢性排斥反应有关.