FISH检测结果:1 肿瘤异质性:不明显     2 :HE

之前的单细胞转录组研究中，许多实验检测的肿瘤微环境分辨率不足，或者忽视了肿瘤与对应的正常样品的比较。并且许多单细胞转录组分析算法则受到高背景噪音、批次效应、技术误差的干扰（原因主要是临床样本采集的条件、批次不同），限制了分析的准确性。

2017年美国Jaxon实验室、新加坡基因组研究所和新加坡国家癌症研究中心共同发表在Nature genetics的题为 Reference component analysis of single-cell transcriptomes elucidates cellular heterogeneity in human colorectal tumors。主要开发了一种叫做 RCA(reference component analysis) 即参考成分分析的新型算法，相比旧算法可以显著提高聚类准确性，对细胞类型、肿瘤微环境的识别率提高。利用这个方法，发现了两种独特的成纤维细胞（CAFs）亚型，其中上皮间质转化（EMT）相关基因显著上调表达；将结直肠肿瘤细胞依据不同的细胞状态和生存概率分成不同的亚型，更准确的细胞分类对预后有一定的指导意义。

肿瘤异质性 包括 肿瘤间异质性 （不同肿瘤细胞之间的基因与表型不同）和 肿瘤内异质性 （相同肿瘤细胞以内的基因与表型也不同），其中 肿瘤内异质性又粗略分为空间异质性 （未扩增的细胞背景中有成簇扩增细胞；少量扩增背景中有未扩增的细胞；孤立的细胞扩增） 与时间异质性 （原初肿瘤与次生肿瘤）。

Nature一篇文章按照其来源分为 患者异质性 (patient hetero?geneity) 和瘤内异质性 ( intratumoral heterogeneity )，其中患者异质性就是指 同种类型肿瘤在不同患者 中表现出差异，瘤内异质性指 同一患者的同一部位 肿瘤内存在的明显差异。

瘤内异质性一直是研究重点，异质性是产生抗药性的主要原因，而异质性产生的主要原因又与肿瘤干细胞的发生、遗传物质不稳定、细胞间竞争等相关。

EMT （epithelial-mesenchymal transition）是Greenberg和Hay于1982年提出的，指的是 可逆的上皮细胞转化为间质细胞 (2014Trends Pharmacol Sci ) 的生物学过程。 上皮细胞将经历持续的细胞活动 , 包括失去顶-底极性结构, 细胞间连接受到破坏, 细胞骨架重构, 改变细胞形态并最终呈现出间质及侵袭表型, 从而增加细胞运动性并提高其降解细胞外基质的能力（2009 Cell）。

恶性肿瘤中绝大多数是 上皮性肿瘤 ，发生EMT的恶性肿瘤细胞将获得增强的迁移及侵袭能力并侵入周围的细胞外基质, 最终向远处位点转移，在结肠癌、甲状腺癌及乳腺癌的侵袭表型中发挥重要作用。发生EMT的细胞具有抵抗细胞凋亡、衰老、化疗和免疫治疗的能力, EMT通过诱导免疫耐受使恶性肿瘤细胞逃避免疫监视。也有研究表明EMT与肿瘤干细胞的特性相关( 2016，Sci Report ； 2016，Sci Report ； 2015，Cancer Letter )

选择11例 II-IV期结直肠癌样本，由新加坡总医院的新加坡国立癌症中心提供。原发肿瘤手术切除后，置于无菌、低温的RPMI培养基中培养。

分离得到的单个细胞生活力由Calcein-AM and Ethidium Homodimer 1 (Live/Dead Kit, Life Technologies) 评估，然后加到RNA–seq IFC-C1 芯片上进行细胞捕获，然后基于 bright-field and Calcein-AM imaging进行芯片成像，只有真正单个的细胞可以继续进行文库制备和测序。

根据cDNA浓度和质量丢弃低质量的单细胞后，利用Illumina 的Nextera XT DNA样本制备试剂盒进行单独的文库制备，然后采用Hiseq2000平台101bp PE方案对总共1591个CRC分离的肿瘤细胞和正常组织配对细胞，以及7个细胞系的630个细胞进行测序。

原始fq数据利用Tophat 2.1.0比对到hg19基因组，利用的是GENCODEv19注释文件(Tophat参数： --read-edit-dist 设置为3， --read-realign-edit-dist 设置为0)。 max-multihits 参数设为1，保证BAM文件中只有一个uniquely mapped reads。表达定量使用Cuffdiff-2.2.1，设置参数 --frag-bias-correct以及 --library-norm-method选择FPKM标准化。为了减少rRNAs, tRNAs以及小RNA（snRNAs and snoRNAs ）对FPKM的影响，需要利用Cuffdiff的 --mask-file 参数，最后导出原始的reads count矩阵。

计算几个统计值：

加入几个看家基因作为参考： TFRC ,ACTB , RPLP0 ,PGK1 ,GAPDH ,LDHA ,NONO ,B2M ,GUSBandPPIH

选择NODG>1000, ROER>5%, ER>0.1M的细胞，总共626个CRC细胞与正常组织配对细胞，561个来自细胞系的细胞。

使用7种细胞系的原始630个细胞(其中561个通过了质控过滤)；为了评估批次效应的处理，其中包含了两个批次： GM12878 (lymphoblastoid) cells 和 H1 embryonic stem cells。

八种方法：All-HC、HiLoadG-HC、BackSPIN、RaceID2、Seurat、VarG-HC、VarG-PCAprojHC、VarG-tSNEproj-HC

评级聚类准确度的指标为ARI(adjusted Rand index)，0-1之前，数值越大表示聚类效果越好

数据集在 GSE72056 ，其中有4645个黑色素瘤细胞的表达数据，主要研究6种细胞类型以及根据marker基因过滤得到的细胞：T细胞( CD2 ,CD3D ,CD3E ,CD3G )，B cells ( CD19 , CD79A ,CD79B ,BLK ), macrophages ( CD163 ,CD14 ,CSF1R ), endothelial cells ( PECAM1 ,VWF ,CDH5 ), CAFs ( FAP ,THY1 ,DCN ,COL1A1 ,COL1A2 ,
COL6A1 ,COL6A2 ,COL6A3 ) and malignant melanoma cells ( MIA ,TYR ,
SLC45A2 )。排除了没有检测到任何marker的细胞，其余细胞在marker表达量的基础上进行层次聚类，最后将4057个细胞划分成了6类

另外利用以上算法分析了黑色素瘤的scRNA数据，结果也是RCA具有近乎完美的准确性，ARI远超其他算法

分析了11个CRC患者的969个细胞以及作为对照的7个患者正常组织的622个粘膜细胞。严格过滤得到375个肿瘤细胞和215个正常粘膜细胞

利用RCAglobal panel 模式一共得到CRC与正常细胞的7种细胞类型：上皮细胞（ epithelial cells）、纤维原细胞（fibroblasts）、内皮细胞（endothelial cells,）、B细胞、T细胞、肥大细胞（mast cells）和髓系细胞(myeloid cells )。其中上皮细胞并没有继续分亚群(比如enterocytes, goblet cells and transit-amplifying (TA) cells)。

为了测试是否为RCA算法导致，又使用了RCA的 self-projection 模式，选择了上皮单细胞转录组数据作为reference panel，结果正常的上皮细胞分成9种亚型，没有发现批次效应，并且分出的亚型和上皮细胞的marker也是可以对应上的，说明了确实可以得到不同的细胞类型或细胞状态。

对肿瘤上皮细胞进行分群，结果得到三个亚群： stem/TA-like, enterocyte 2B–like and goblet-like。其中 stem/TA-like占到93%，而之前正常粘膜上皮细胞中只有30%，这也与CRC细胞的增殖特性一致。

因此，即使临床样本存在批次效应，但是正常粘膜与CRC细胞中依然可以较为准确地识别细胞类型。

先进行一个假设：scRNA与bulk RNA对肿瘤-正常组织得到的差异基因存在显著差异。对scRNA的结果分析：从肿瘤样本中选择了5个最大的细胞群( stem/
TA-like epithelial cells, fibroblasts, B cells, T cells and myeloid cells)，每个细胞群与正常粘膜细胞群比对，共得到129个差异基因(FDR<0.05)。其中 stem/TA-like cells 和fibroblasts的差异基因数量最多。所有的差异基因放在了： /original/nature-assets/ng/journal/v49/n5/extref/ng.3818-S1.pdf的 Supplementary Note中，并且有许多在之前的CRC功能研究中被报道。总体来说，大部分在scRNA中检测的差异基因在bulk RNA中没有检测到，从另一个方面展示了scRNA的优越性

利用IPA(Ingenuity Pathway Analysis)鉴定了四种细胞类型的上游调控元件，发现前3名的元件包含了2个小分子：放线酰胺素Actinonin和莫特沙芬钆 Motexafin gadolinium。Actinonin在多种癌症细胞（包括结肠直癌）中起到抑制生长的作用，Motexafin gadolinium主要在干细胞中发挥作用，诱导癌细胞凋亡

另外，TGFB1( transforming growth factor B1)是排名最高的内源性上游调控因子，在CAFs激活通路中活性增强，同时SMAD3（ TGF-β effector ）也增强。另外TGFB3和LTPB1(编码 TGF-β结合蛋白)在CAFs中表达比正常黏膜成纤维细胞表达更多。在正常黏膜成纤维细胞中，TGF-β响应基因如 TGFBI ,CTGFandBHLHE40主要在pithelial cells 和CAFs 中表达，说明由CAFs分泌的TGF-β可能激活肿瘤上皮细胞中的TGF-β通路。

上图中红色的CAFs的一些TGF-β基因表现出了"双峰表达 Bimodal expression "的情况(遗传相同表型多样)，然后用RCA的self-projection模式对CAFs进行聚类，分成了NMFs(normal mucosa fibroblasts)、CAF-A and CAF-B三类，之后CAF-B细胞基因差异分析得到marker基因 ACTA2 , TAGLNandPDGFA上调表达，它们在CAF-A中下调；CAF-A中上调的有 MMP2 , DCNandCOL1A2

因此，CRC肿瘤中的CAFs主要有两种亚型，具有不同的转录表达

利用SI(stemness index) 【由已知的42种结肠或肠道干细胞marker基因平均表达水平得到】在肿瘤和正常组织中的分布，结果发现肿瘤细胞的SI值更高，约5%的肿瘤细胞SI值高于正常组织。然后将干细胞的SI值与基因表达量结合，发现了5个基因与干细胞作用相关，其中有3个与 WNT信号通路 相关( GPX2 ， OLFM4and RNF43 )。

有趣的是，lncRNA编码基因 XIST（可以介导女性X染色体失活）也被发现与干细胞性相关，不过在正常样本中 XIST与SI评分无关。

总的来说，肿瘤干细胞的特性是一个不断变化的过程，并与XIST和WNT介质的表达相关

之前有一种假设："上皮细胞转化为 间充质 状态，这样就允许它脱离并转移到其它位置"，转录水平上，EMT的特征是上皮组织的markerCDH1下调表达，间充质转录因子TWIST, SNAIL and ZEB家族的上调表达。为了检测CRC中的EMT发展情况，检测了以上基因及其它细胞类型的marker基因的表达

并没有观察到肿瘤和正常粘膜上皮细胞的CDH1的表达差异，而且肿瘤与正常组织上皮细胞都没检测到EMT转录因子。相反，发现一些转录因子在CAFs（图中红色区域）中上调，不过这个变化和EMT的发生没有直接关系，因为fibroblast(成纤维细胞是间充质细胞)。为了进一步研究，文章结合了上图中的9个EMT上调基因的表达量，定义了每个细胞中EMT的评分，确定了肿瘤上皮细胞缺乏EMT信号，而CAFs中EMT信号显著增强。

之后为了排除组织切除带来的人工干扰，又使用了单分子FISH(smFISH)对肿瘤mRNA分子进行可视化，结果发现EMT的markerSNAI1、ZEB1和TWIST1的表达与成纤维细胞的markerSPARC 表达一致，并且在表达EPCAM的上皮细胞中检测不到。免疫组化与生信分析结果是一致的。

目前已经利用常规bulk转录组根据治疗反应和患者生存率，将CRC分成不同亚型。但是这种分类会受到不同类型间质细胞转录组的影响。因此文章利用了scRNA得到的6这种细胞型，然后结合了6个独立的带有生存信息注释的常规转录组数据：TCGA、GSE14333、PRECOG37以及一项相关研究的 三个数据集 。将bulk数据投射到6个细胞型上，并在每个细胞型中都鉴定到了三个肿瘤组：S1、S2、S3（图a）。其中S1肿瘤上皮细胞特征较弱，成纤维细胞较强，髓样特征较强；S2所有特征处于中等水平；S3上皮细胞特征较强，其余较弱（图b）。

接着讨论了新定义的CRC亚型的预后意义。6个细胞型中，S3肿瘤生存率最高(图a)，这和之前研究成纤维细胞与患者预后的关系结果一致。来自GSE14333数据集的bulk转录组数据中 ‘enterocyte’ and ‘goblet-like’CRC肿瘤亚型中包含了这里分析的S2、S3亚型（图c）。在 ‘enterocyte’ 和 ‘goblet-like’亚型中，S3肿瘤比S2的存活率更高。进一步强调了 CAFs与CRC预后的潜在相关性，利用单细胞转录组推断的细胞类型对预后具有一定的价值。

肿瘤标志物检测的影响因素有哪些

　　目前，已被发现的肿瘤标志物(TM)有100多种，这些TM检测结果可对患者产生直接影响。在实际工作中，影响TM检测的因素很多，涉及分析前、分析中和分析后各个环节。下面是我为大家带来的肿瘤标志物检测的影响因素有哪些的知识，欢迎阅读。

　　一分析前影响因素

　　1、临床诊疗措施对TM的影响

　　前列腺按摩、前列腺穿刺、导尿和直肠镜检查后，血液中前列腺特异性抗原(PSA)和前列腺酸性磷酸酶(PAP)可升高。某些药物会影响TM浓度，如抗雄激素治疗前列腺癌时可抑制PSA产生;丝裂霉素、顺珀等抗肿瘤药可导致PSA假性升高;一些细胞毒药物(如5-氟尿嘧啶)治疗肿瘤时，可使癌胚抗原(CEA)暂时升高。

　　2、肝肾功能异常的影响

　　肝功能异常、胆道排泄不畅、胆汁淤滞等均可造成CEA、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酰转移酶(GGT)和细胞因子等浓度增高。肾功能不良时细胞角蛋白质19片段(CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原(SCC)和?2微球蛋白(?2-MG)可升高。

　　3、生物学因素的影响

　　随年龄的增长PSA升高;老年人CA199、CA153、CEA等可升高。部分妇女在月经期CA125和CA199可升高。在妊娠期甲胎蛋白(AFP)和CA125等明显升高。某些长期抽烟者中可见CEA升高。

　　4、标本采集和保存的影响

　　由于红细胞和血小板中也存在神经元特异性烯醇化酶(NSE)，标本溶血可使血液中NSE浓度增高。通常血液标本采集后应及时离心，保存于4℃冰箱中，并在24h内测定;不能在24h内测定的血清应贮存于-20℃冰箱内;须长期贮存的标本应置;-70℃保存，且应防止反复冻融。酶类和激素类TM不稳定，易降解，应及时测定或分离血清低温保存。此外，试管内的促凝剂对某些TM有干扰;呼吸道分泌物、唾液和汗液等污染标本，可使SCC、CA199和CEA升高。

　　二分析中影响因素

　　1、测定方法和试剂的影响

　　TM测定方法有放射免疫测定法(RIA)、酶联免疫测定法(ELISA)和化学发光免疫测定法(CLIA)等。手工方法，由于加样、洗涤、温育、制作标准曲线等操作步骤多，则重复性较差，人为误差较大。自动化仪器测定，重复性好，人为误差小，但是不同厂家、不同试剂盒测定有差异，原因是使用的单克隆抗体针对抗原的位点不同所致。有时使用同一种抗体，也可能因抗原异质性或基质的影响而得到不同的结果。导致分析中误差的主要原因是缺乏测定的标准化，包括缺乏统一的抗原成分、校准品和参考方法等。因此，要尽量使用同一方法，同一仪器和同一厂家试剂盒进行测定。

　　2、?钩状效应?的影响

　　若待测样本中抗原浓度过高，会出现高浓度后带现象(?钩状效应?)，此时免疫反应被明显抑制，测定结果偏低，要消除此干扰，只有对样本进行适当稀释后重新测定。

　　3、交叉污染的影响

　　在测定高浓度标本时，交叉污染成为一个导致假阳性的潜在问题。特别是紧随在高浓度标本后一标本，若出现偏高结果，应复查有无交叉污染。

　　4、嗜异性抗体对检测结果的影响

　　大多数TM测定中常使用一对鼠单克隆抗体与肿瘤抗原反应，如患者因闪烁影像学检查或治疗时使用过鼠单克隆抗体，则体内会产生人抗鼠抗体(HAMA)，血清中的HAMA可在"种鼠单克隆抗体间起?桥梁?作用，导致无抗原情况下，出现TM浓度增高的假象。对有动物密切接触史者要特别注意嗜异性抗体问题，以避免假阳性而带来医疗纠纷。

　　5、抗原和抗体反应对TM测定的影响

　　抗原抗体反应系指抗原与相应抗体间所发生的特异性结合反应，受抗原抗体的性质、活性、效价、反应比例及环境(如电解质，pH值，温度)等因素影响。

　　三分析后 影响因素

　　1、TM的参考值范围

　　不同的标本类型如血液、尿液、胸腹水等，必须有不同的.参考值。不同地区、人群、方法、试剂和设备应建立自己实验室的参考值范围。但目前临床使用的参考值大多为国外文献报道的数据，很少有国内自己的参考范围，对此应向临床说明，供临床诊断和分析疾病时参考。

　　2、TM基础测定值变化

　　每个人的TM水平是未知的，且波动较大。在监测患者治疗前、中、后各阶段TM含量的变化时，最好作TM含量变化的曲线图，并以治疗后TM的水平作为特殊的?参考水平?，这对判断疗效和监测复发有很大价值。

　　3、与临床的交流和沟通

　　由于TM测定对临床诊疗有特殊性，必须加强与临床的交流和沟通，当改变TM检测方法和试剂时，必须通知临床，以免影响结果的判断。

　　总之，影响TM检测的因素很多，要达到检测的标准化和规范化以及各实验室间结果的可比性，还有大量的工作要做。但是，全面了解和掌握TM的特点，合理科学使用TM，严格执行操作规程，避免分析前、分析中、分析后等不良因素对检测结果的影响，定将使TM检测在肿瘤的诊断与防治中发挥更重要的作用。

按照以上病理结果，T1cN0Mx，考虑为乳腺癌1期，即早期，预后好；

ER、PR强阳性，CerbB-2阴性，Ki67弱阳性，典型的luminal A型乳腺癌，而且患者已闭经，预后好；
术后推荐治疗方案为内分泌治疗。并做好定期复查。

目前治疗观点阿霉素不宜与赫赛汀同时应用，该改为序贯，化疗结束后全面复查后考虑是否锁骨上淋巴结活检。

（于志勇大夫郑重提醒：因不能面诊患者，无法全面了解病情，以上建议仅供参考，具体诊疗请一定到医院在医生指导下进行！）

山东省肿瘤研究院于志勇 /